院士团队领衔：多中心前瞻性盲法验证，多基因cfDNA甲基化模型在肝癌早期无创诊断中的应用

由空军军医大学西京医院窦科峰院士团队、复旦大学附属中山医院樊嘉院士、周俭院士团队领衔，联合首都医科大学附属北京佑安医院、中山大学附属第三医院等国内多家肝胆中心开展的一项多中心、前瞻性、盲法验证研究，近期在线发表于《Clinical and Translational Medicine》杂志。研究结果表明，基于RNF135、CHFR和PAX5三个cfDNA甲基化标志物构建的LC-HMC诊断模型，在肝癌检测中表现出优异的灵敏度和特异性，尤其是I期肝癌灵敏度达93.1%，整体性能优于传统血清甲胎蛋白（AFP）检测，为肝癌高危人群的早期无创筛查和辅助诊断提供了新的循证医学依据。

区别于多数局限于生物标志物发现阶段的同类研究，本研究建立了从候选位点筛选到临床验证的完整证据链：从公共数据库与多中心临床样本中筛选潜在靶点，经多轮定量甲基化特异性聚合酶链式反应（qMSP）验证和训练/测试集建模优化，最终进入1097例受试者的前瞻性临床试验。这种递进式的研究设计，系统呈现了该技术的创新性、严谨性和临床转化潜力。

在全球范围内，原发性肝癌是发病率和死亡率均居前列的恶性肿瘤，我国肝癌疾病负担尤为突出，每年新发病例和死亡病例均占全球近一半。早期诊断率低是肝癌预后较差的核心原因之一，多数患者确诊时已处于中晚期，总体5年生存率不足15%；而早期肝癌患者经根治性治疗后，5年生存率可提升至60%-70%。

目前临床常规采用的“腹部超声联合血清AFP”筛查方案存在显著局限。AFP对肝癌的整体灵敏度为45.3%-62.0%，对I期肝癌的灵敏度仅40%-54%，且约30%的良性肝病患者会出现AFP假阳性升高；腹部超声对小于1cm的微小肝癌检出率低于30%，且高度依赖操作者经验。这一现状导致大量乙肝携带者、肝硬化患者等高危人群无法早期发现病变，错失根治性治疗机会。

液体活检技术的出现为癌症早诊带来了新方向。其中，cfDNA甲基化检测因其具有发生早、组织特异性高、信号稳定等优势，成为颇具潜力的早检标志物。与基因突变相比，DNA甲基化是癌症发生发展过程中的早期分子事件，在癌前病变阶段即可检测到异常；且不同组织来源的肿瘤具有独特的甲基化谱，能够实现肿瘤的组织溯源。

本研究选择cfDNA甲基化作为肝癌无创诊断的技术方向，具有清晰的临床逻辑：一方面旨在提升早期肝癌的检出能力，另一方面也致力于在良性肝病和其他恶性肿瘤等复杂临床背景下保持足够特异性。

本研究采用“标志物筛选-模型构建-临床验证”三阶段研究设计，将公共数据库分析、自建样本验证、标准化检测体系建立与前瞻性临床试验有机衔接，通过层层递进的验证流程逐步提高证据强度。

在标志物发现阶段，研究团队首先对TCGA数据库中的375例肝癌组织和50例癌旁正常组织进行全基因组甲基化测序分析，筛选出30个在肝癌中显著高甲基化的基因。随后，通过qMSP技术在肝癌细胞系、配对癌组织/癌旁组织及血浆样本中进行多轮验证，最终锁定了RNF135、CHFR和PAX5三个具有肝癌特异性的标志物。

这三个基因均为已被证实的抑癌基因，其启动子区高甲基化会导致基因表达沉默，进而参与肝癌的发生发展过程：RNF135编码E3泛素连接酶，与肝癌抗病毒免疫调控相关，其表达下调可促进肝癌细胞迁移侵袭；CHFR作为细胞周期检查点基因，其失活会导致基因组不稳定和细胞增殖失控；PAX5是关键转录因子，在细胞分化和增殖调控中发挥重要作用。

研究证实，这三个标志物在肝癌组织中呈现特异性高甲基化状态，而在健康人群、良性肝病患者及其他多种恶性肿瘤患者中均保持低甲基化。

图1：肝癌前30个高甲基化基因热图

图2：9个高甲基化基因在肝癌细胞系、组织及血浆样本中的敏感性

基于三个标志物的qMSP检测结果，研究团队采用逻辑回归算法建立了LC-HMC诊断模型，并在包含280例样本的训练集和124例样本的测试集中完成了参数锁定和初步验证。

从临床转化角度看，本研究的重要考量是选择qMSP平台。与基于下一代测序（NGS）平台的甲基化检测技术相比，qMSP平台具有操作简便、检测周期短（数小时 vs NGS数天）、成本低、易于标准化等优势，更适合在各级医院推广应用。

为全面评估LC-HMC模型在真实临床场景中的应用价值，研究者开展了一项前瞻性、多中心、盲法临床试验。研究共纳入来自四家肝胆中心的1097名受试者，包括521例肝癌患者、455例良性肝病患者和121例其他恶性肿瘤患者。样本量的设计不仅能够评价模型的总体性能，也能够对早期肝癌、良性肝病等影响临床决策的关键亚组进行分析，同时检验模型能否特异性识别肝癌相关甲基化信号，而非对所有癌症产生泛阳性反应。

本研究设置了“已确诊组”和“待确诊组”，其中待确诊组纳入646例患者，入组时尚未明确诊断，占全部入组病例的近六成（58.89%），所有甲基化检测均在病理诊断结果揭晓前完成，确保盲法。这种设计有效避免了回顾性研究中常见的选择偏倚和信息偏倚，最大程度模拟了真实临床筛查场景，提高了研究结果的客观性和外推性。

在521例肝癌患者和455例良性肝病患者中，LC-HMC模型的整体灵敏度为94.43%（95% CI: 92.12–96.09%），整体特异性为95.16%（95% CI: 92.78–96.78%）。混淆矩阵分析显示，492例肝癌被正确检出，433例良性肝病被正确排除，总体准确率达到94.77%。该模型在保持较高灵敏度的同时，并未牺牲特异性，在肝癌高危人群常见的良性肝病背景下仍具有良好的鉴别诊断能力。

图3：混淆矩阵

LC-HMC模型区分肝癌与良性肝病的曲线下面积（AUC）为0.9714（95% CI: 0.9603–0.9824），区分肝癌与其他121例非肝恶性肿瘤的AUC为0.9584（95% CI: 0.9367–0.9801）。在各类良性肝病中，模型的特异性均保持在90%以上：肝硬化92.78%，良性肝肿瘤95.54%，乙肝95.83%，丙肝93.75%，脂肪肝100%；在非肝恶性肿瘤中，特异性也达到90.00%-93.55%。

图4：区分肝癌与良性疾病的ROC曲线

图5：区分肝癌与其他癌症的ROC曲线

LC-HMC模型在不同临床分期肝癌中均表现出稳定的检测性能：I期为93.10%（95% CI: 89.78–95.40%），II期为94.20%，III期为97.35%，IV期为100%。与之相比，传统AFP检测在同一队列中的各分期灵敏度均低于LC-HMC模型，其中I期AFP的灵敏度仅为54%。本研究中I期肝癌患者占比达61.23%（319例），其中待确诊组贡献了267例I期病例，该组I期灵敏度仍达到92.88%。

图6：LC-HMC模型和AFP检测在肝癌各阶段的灵敏度比较

图7：肝癌病例中各临床分期比例

LC-HMC模型在不同年龄、性别、肝癌亚型（肝细胞癌、混合型肝癌）及肿瘤分化程度（低、中、高分化）的患者中，灵敏度均超过90%。各中心独立报告的灵敏度和特异性也均超过90%，表明该模型在不同地区、不同医疗机构中均能保持稳定的诊断性能。

研究发现，LC-HMC模型的整体性能优于单个甲基化标志物。在492例真阳性样本中，RNF135检出437例（其中5例为唯一阳性），PAX5检出417例（其中7例为唯一阳性），CHFR检出448例（其中16例为唯一阳性）。这种互补性能够覆盖不同分子亚型的肝癌，进一步提升了模型的整体检测效能。

图8：各甲基化标记区分的真阳性病例数量

对46例接受根治性手术切除的肝癌患者进行术前术后配对检测发现，41例术前阳性患者术后全部转为阴性；另有5例术前即为阴性，术后仍为阴性。这一结果提示，血浆中这三个基因的甲基化信号主要来源于肿瘤组织，肿瘤切除后信号随之消失，为肝癌术后复发监测提供了研究方向。

本研究通过严谨的多中心前瞻性盲法临床试验，为RNF135、CHFR和PAX5三基因甲基化检测在肝癌早期诊断中的应用提供了高质量的循证医学证据。该模型对I期肝癌的灵敏度达到93.10%，优于传统AFP检测，尤其在AFP阴性肝癌患者中仍保持94%以上的灵敏度，能够有效覆盖AFP筛查盲区。

临床实践中，LC-HMC模型可作为现有筛查手段的有效补充。对于乙肝携带者、肝硬化患者等肝癌高危人群，将甲基化检测与超声、AFP联合使用，有望进一步提高早期肝癌的检出率，使更多患者获得根治性治疗的机会。同时，基于qMSP平台的检测体系操作简便、成本可控，便于在各级医院推广应用。

基于本研究成果开发的博尔诚思博甘^®RNF135、PAX5、CHFR基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)已获得国家药品监督管理局批准上市。该研究为临床转化奠定了高质量的循证基础，未来大规模真实世界研究将进一步验证该模型在不同病因肝癌人群中的适用性，以及在术后复发监测中的应用价值，同时优化与现有筛查手段的联合应用方案，为肝癌全病程管理提供支持。