“绝代双骄”联手破解肿瘤液体活检“难以精准”的困局

发表时间：2021-10-14 19:21

自然杂志新文章揭示

肿瘤液体活检“难以精准”的真相

早筛网讯：近期，《自然》发表了一篇学术研究文章，对来自5个供体的9个器官的1737个形态正常的组织活检进行了全面的基因组分析。研究发现，在形态正常的人体组织中，尽管程度不同，体细胞突变积累和克隆扩增广泛存在，同时也包含与肿瘤相关的大量突变[1]。早在在2019年《科学》的一篇文章，来自美国哈佛-麻省理工的博德研究所的Gad Getz教授研究团队，首次对人体不同组织中正常细胞的突变进行了全面综合的分析，同样发现在正常组织中不同程度地检测到了携带体细胞突变的遗传克隆，其中一些竟然携带有癌症相关突变[2]。同年的《自然》子刊发现癌症患者血液中大部分突变不是来自于癌细胞。MSKCC团队发现，癌症患者血液中一半以上的突变来自于白细胞[3]。这些发现也有助于我们更好地理解癌症。其实在这几项研究之前，科学家们就已经认识到健康的组织里也有很多突变，甚至是和癌症相关的突变，但这些突变并不总会驱动癌症的发生。研究人员们指出，这可能仅仅是因为这些突变是癌细胞从健康细胞里遗传来的，不代表它们就真的会引起癌症。这些研究结果提示我们，目前以ctDNA为研究核心的液体活检高通量测序技术，很难突破复杂的背景噪音以及ctDNA来源问题的“困境”，在实际临床应用中还需要更有效的技术方法！

液体活检现有临床检验技术平台均存在短板

肿瘤液体活检的概念已经提出了多年，其中循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA（ctDNA)是目前肿瘤精准医学应用研究的热点与重点。ctDNA是由肿瘤细胞坏死、凋亡或者正常分泌到血液中DNA片段，其携带了肿瘤相关的基因变异信息；CTC是从肿瘤原发灶或转移灶进入血液的肿瘤细胞，其包含了完整细胞所携带的全部信息，包括肿瘤相关蛋白的表达量、染色体变异水平、肿瘤基因突变等。虽然ctDNA检测目前主要应用于靶向药物基因检测以及疗效耐药监测中，但是除了上述研究中存在的不可避免的来源问题，在临床实际应用中也面临着诸多问题：比如含量稀少、NGS灵敏度不够、临床指导意义不强、成本价格昂贵等。而在临床应用多年的CTC在相关检测技术方面也难以突破，灵敏度和特异性还有待进一步提高。临床对于目前技术所捕获的细胞是否是肿瘤细胞，尚有存疑。同时临床应用停留在计数阶段，难以摆脱“鸡肋”的尴尬地位。

目前已进入临床应用的肿瘤液体活检技术平台

从上表中我们可以看到，目前荧光PCR 和NGS（二代高通量测序）的灵敏度都难以满足肿瘤液体活检对技术平台检出限的要求。数字PCR是目前大家都比较看好的液体活检技术平台，与相对定量的荧光PCR相比，其优势在于可以将一份标本通过液滴技术分割成几万甚至几十万个“独立的微滴单元”，从而对目标核酸片段（DNA）进行绝对定量的检测分析。与NGS检测液体标本灵敏度偏低、费用昂贵且检测周期较长相比，数字PCR具有“检测结果更精准、费用便宜近一半、当天可出结果”的巨大优势，特别是针对肿瘤液体活检中的低丰度基因突变检测、融合基因检测、乳腺癌分期、甲基化分析、单细胞基因表达分析、微小残留病灶检测和外周血microRNA绝对定量方面，数字PCR的优势十分明显，但是只具有检测更精准优势的数字PCR仍然解决不了“如何甄别来源于非癌细胞的基因突变”问题！

全球首款采用微针打印技术的晶准无芯式数字PCR

创新“最佳拍档”或成液体活检破局关键

来自香港城市大学生物医学系的科研团队认为，液体活检在癌症筛查和早期检测的应用，必须是多维度标志物(蛋白/基因/细胞)和多组学层面的结合，单一类的肿瘤标志物(如蛋白标志物或ctDNA突变或DNA甲基化)在灵敏度和特异性方面有很大的局限性。要提高肿瘤早期筛查和诊断的准确性，必须把CTC作为核心信息源(完整的肿瘤细胞)与其他肿瘤标志物相结合。近年来，他们结合CELLOMICS CTC100平台和高通量单细胞测序技术，建立了多种癌症的CTC单细胞全基因组的数据库，为CTC与ctDNA及其他标志物的联合使用奠定了理论和实验数据基础。

针对肿瘤液体活检单一检测平台面临的技术困境，该团队率先提出了“基于CTC的多重生物信息鉴定结合靶基因突变检测”的互证式检验策略，采用“CTC+数字PCR”的双平台联合检测方案，不但破解了目前基于血液样本的ctDNA检测技术的来源问题“困局”，还可以在基因层面印证细胞的肿瘤来源，并为临床提供更有针对性的用药指导信息。在患者无法取得组织标本（或组织标本比较早期）的情况下，该方案可以同步获得肿瘤的动态监测、PD-L1免疫治疗和靶向用药数据，为患者和临床医生提供了一个更完整、更精准的肿瘤液体活检解决方案，非常适合现有的PCR实验室开展针对肿瘤液体活检的临床检验业务。

今年上半年，该团队配合江苏省某三甲医院在国内首次针对第三代微流控CTC平台做了近五个月的对比测试，尝试验证目前国内最先进的几个CTC平台是否可以真正实现“通过准确的CTC计数分型实现精准的肿瘤动态监测、通过基于CTC的PD-L1蛋白检测辅助诊断肿瘤免疫治疗、通过捕获具有活性的完整肿瘤细胞开展下游基因检测、细胞培养”等。结果惊喜发现CTC100平台不但可以捕获具有活性的完整循环肿瘤细胞，而且24小时肿瘤细胞活率达到了83％。在国内多家大型三甲医院的临床验证中，该技术平台基于CTC上的PD-L1检测与金标准的符合率达到了95%以上。据悉，该团队多年前已经实现了CTC单细胞基于数字PCR技术的肿瘤靶向基因检测（EGFR、KRAS、NRAS等）可行性验证，发现在保证CTC单细胞捕获质量的前提下，靶药基因的检测结果与临床金标准也非常接近。相信随着越来越多临床数据的验证，“CTC+数字PCR”这一创新的双平台联检方案，非常有希望突破目前大多数单一肿瘤液体活检平台面临的技术瓶颈，成为肿瘤精准医学中心开展肿瘤液体活检的必备“最佳拍档”。

采用惯性聚焦微流控芯片的晶准CTC-100平台，可以无损捕获CTC。灵敏度和特异性均达95%以上。临床符合率较高，细胞完整性和活性能较大程度的保持。

晶准生物医学（深圳）有限公司是专注于肿瘤液体活检领域的国家高新技术企业。近日，它们采用创造性的“微针打印微滴技术”替代了传统数字PCR上百元成本的微流控芯片技术，拿到了全球第一张“无芯片式”数字PCR的注册证，并在此基础上结合它们自主研发、国际领先的CTC100循环肿瘤细胞检测平台，针对肿瘤液体活检推出了“CTC+数字PCR”的双平台联检方案，为肿瘤液体活检多年无解的技术困境提供了一个全新的思路。

参考文献：

[1] Li R, Di L, et al. A body map of somatic mutagenesis in morphologically normal human tissues. Nature. 2021 Sep;597(7876):398-403. doi: 10.1038/s41586-021-03836-1.

[2] Yizhak K, Aguet F, et al. RNA sequence analysis reveals macroscopic somatic clonal expansion across normal tissues. Science. 2019 Jun 7;364(6444):eaaw0726. doi: 10.1126/science.aaw0726.

[3] Razavi P, Li BT, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants. Nat Med. 2019 Dec;25(12):1928-1937. doi: 10.1038/s41591-019-0652-7.

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